化學(xué)發(fā)光試劑盒的原理

 　　化學(xué)發(fā)光作為一種分析工具的吸引之處就在于檢測的簡(jiǎn)單性?；瘜W(xué)發(fā)光的實(shí)質(zhì)是自身發(fā)光，這意味著(zhù)化學(xué)發(fā)光的分析測試儀器只需要提供一種可以檢測光信號和紀錄結果的方法就可以了。自發(fā)光檢測儀需要一個(gè)閉光的樣品室和光檢測器。zui簡(jiǎn)單的便是相片紙或X光片，甚至視覺(jué)檢測器都可以。

　　化學(xué)發(fā)光檢測方法的簡(jiǎn)單性使得它的應用很簡(jiǎn)單并且*可以自動(dòng)化。但是它的靈敏度又是怎么樣的呢?化學(xué)發(fā)光有如下兩個(gè)內在的優(yōu)勢：

　　1.絕大多數的樣品沒(méi)有“背景”信號，如它們自身不發(fā)光。

　　2.化學(xué)發(fā)光的檢測不是一個(gè)比例測試，這是與熒光和吸收或比色測試不同的。在熒光測試中，具有小的Stokes Shift的熒光基團非常難檢測。熒光很難從激發(fā)波長(cháng)中分辨出來(lái)。

　　另外一個(gè)問(wèn)題是，特別在樣品是渾濁的情況下有一部分雜光會(huì )進(jìn)入到檢測器。

　　在吸收光測試上，其靈敏度受到限制的根本因素是需要在兩個(gè)相對較強的信號之間去區分一個(gè)較小的差別。

　　需要注意的是檢測器對光譜的敏感性近可能接近化學(xué)發(fā)光的光譜，以得到zui大化的靈敏度。一般在自發(fā)光儀中的光電倍增管對藍光有*的反應，對紅光的末端光譜不太敏感。固態(tài)檢測器對紅光有較好的反應。

　　X光片廣泛用于記錄在尼龍膜、纖維素膜或PVDF膜上的化學(xué)發(fā)光印跡分析。但是我們需要牢記在心的是X光片僅能夠用于檢測紫外到藍光光譜范圍內的光信號，雖然有一些特殊的光片對增強的綠光有敏感性。

　　液體樣品的檢測

　　有一些特定的詞來(lái)描繪化學(xué)發(fā)光檢測：靈敏度、線(xiàn)性和動(dòng)態(tài)范圍。每一個(gè)詞的意義如下：

　　1.靈敏度指的是某種東西可靠檢測的zui低水平。“某種東西”是指在一個(gè)分析測試中的測試物。測試物是被標記了一種可檢測的東西，如化學(xué)發(fā)光化合物或的一種酶。分析物也可以是一種通過(guò)與具有標記的親合物有特異性結合反應而檢測的物質(zhì)。所謂的可靠檢測指的是針對一個(gè)空白測試樣品，檢測器能夠重復感應到zui低水平的信號，而這種信號是由所檢測物本身產(chǎn)生的。

　　2.線(xiàn)性描述的是信號與分析檢測物濃度范圍之間的關(guān)系。理想的比例因子是常數;信號點(diǎn)與分析檢測物是一條直線(xiàn)關(guān)系。標準曲線(xiàn)可以不是直線(xiàn)，如s形，仍是有用的。

　　3.動(dòng)態(tài)范圍指的是被檢測物濃度與信號單一模式的變換范圍。它定義的是分析的工作范圍。

　　你期望通過(guò)化學(xué)發(fā)光得到什么水平的靈敏度呢?答案不一定會(huì )滿(mǎn)足你的要求，“它是有條件的”。在很少情況下，檢測器的靈敏度或化學(xué)發(fā)光方法會(huì )是檢測的局限因素?，F在的檢測器可以達到很高的靈敏度。大多數情況下，而是其它的一些因素顯示了分析檢測的靈敏度。zui通常的是生物成分(抗體、酶等)的非特異性結合到反應容器和支持物的表面。例如，免疫分析，印跡實(shí)驗，核酸雜交和其它的酶聯(lián)結合實(shí)驗都是受制于此因素。

　　管和微孔板

　　玻璃、透明或半透明的塑料管、比色皿是化學(xué)發(fā)光測試比較理想的材料。理想的是光能夠通過(guò)一個(gè)平面然后測試，以減少邊際效應。曲面也可以使用，如圓柱型的測試管。用不同的測試管測試比較結果，這些管必須是統一生產(chǎn)的，才可以比較結果。

　　微孔板——從化學(xué)發(fā)光反應中發(fā)射出的光是各向同性的，即在各個(gè)方向上同等發(fā)射出來(lái)的。如果一個(gè)化學(xué)反應是在透明的微孔板中的微孔中進(jìn)行，光不僅從垂直方向發(fā)散，還從水平方向發(fā)散出來(lái)。光很容易的通過(guò)各個(gè)孔之間的間隙和孔壁。光較強的孔就會(huì )干擾相鄰的孔。因此，化學(xué)發(fā)光測試一般不用透明微孔板。

　　不透明的微孔板和板條主要有兩種——白色和黑色。使用者需要注意的是黑色的因為有光吸收，所以它的信號會(huì )比白色板有很明顯的減弱(將近10倍)。因為所有的孔是同等比例的收到影響，所以不管他們的強度，定量并沒(méi)有問(wèn)題。白色或黑色板的選擇，主要是基于預期檢測信號的強弱，白色板用于檢測較弱光的檢測，黑色板用于檢測強光的檢測。黑色板的另一優(yōu)點(diǎn)就是可以削弱非特異性結合所帶來(lái)的問(wèn)題。

　　此外，白色板并不是*同等不透明。為熒光設計的白板的白色素比用于化學(xué)發(fā)光的白板的要少的多。在熒光檢測時(shí)，每檢測一次，一般在針對一個(gè)孔，消除了相鄰孔之間的干擾。白色微孔板的好壞很容易檢測，只要在板的后面放上一只燈，然后看每個(gè)孔。如果穿過(guò)的燈光不僅僅是淡淡的，那么用于較強的化學(xué)發(fā)光底物的分析是會(huì )有一些問(wèn)題的。

　　固態(tài)檢測

　　光電二極管能夠感應比光電倍增管所感應的更強的光強度。對于那些需要測試高強度光的應用，選擇這樣的檢測器比較好。然而，固態(tài)檢測器的暗電流比光電倍增管一般要高很多。解決這個(gè)問(wèn)題的方法之一是通過(guò)Peltier或者是其它的熱電制冷設備冷卻固態(tài)檢測器。在0～30攝氏度范圍內，固態(tài)檢測器的暗電流隨溫度的降低會(huì )急劇下降。冷卻的檢測器能夠整合1到100秒范圍內所檢測到光信號而不會(huì )被暗電流所覆蓋。

　　CCD和其它的固態(tài)檢測器擁有以下幾個(gè)內在的優(yōu)點(diǎn)：

　　1、在可見(jiàn)光譜范圍內，固態(tài)檢測器有一個(gè)較好的光譜響應。發(fā)光反應發(fā)出紅光，甚至近紅外光。

　　2、CCD影像系統可以對不同的目標物進(jìn)行檢測?；旧先魏我环N樣品或容器都可以適用，如微孔板，細菌測試管或細胞培養皿，電泳凝膠和印跡膜。

　　3、單個(gè)PMT系統在測讀之前必須對樣品位置進(jìn)行定位。樣品管重復多次帶到一個(gè)固定位置，然后重復測讀。微孔板PMT測讀儀依賴(lài)于微孔之間的標準間隔，能夠按照一個(gè)預算好的位置移動(dòng)微孔板，由此微孔一個(gè)接著(zhù)一個(gè)的測讀。而攝像系統測讀一個(gè)樣品不需要預先知道它的位置，例如膜上的一個(gè)條帶。影像系統能夠把樣品的濃度和位置信息給出。

　　4、CCD影像系統能夠同時(shí)獲得大量樣品的信息。如對96、384或更多數目的微孔板的數據的同步收集并不是一個(gè)奢望。固態(tài)影像系統可以一次就獲得整個(gè)微孔板的影像和定量。

　　儀器設計者或終端使用者需要注意的是影像檢測器對于微孔板樣品的檢測存在一個(gè)重大的缺陷：三維的微孔板相比于二維檢測物(如膜)會(huì )產(chǎn)生一個(gè)邊際效應。因為光強度按照距離平方的倒數逐漸變弱，所以把攝像頭放到盡可能離板近的地方由此可以得到的結果。然而，因為孔是有深度，zui遠孔的整個(gè)底部就可能看不到。這個(gè)孔的邊緣部分的光信號就很可能檢測不到。

　　提高攝像頭將削減檢測器所獲得的整體的光強度。幾何計算模式可以拿來(lái)應用以彌補邊際強度的丟失，但是外圍孔的信噪比必然比中央孔的要差。

　　CCD應用zui普遍的設備系統為帶制冷CCD的化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統。為了提高檢測速度和通量，有時(shí)也把CCD應用到高通量的板式化學(xué)發(fā)光檢測儀上。

　　固相樣品的檢測(印跡膜)

　　X光片——它已經(jīng)被認為是對固定在膜上的蛋白或核酸進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測的強有力的工具，如Southern、Northern和Western雜交的化學(xué)發(fā)光檢測。此類(lèi)商業(yè)化的產(chǎn)品已非常廣泛。

　　如果能夠控制好非特異性的結合，靈敏度是足夠的。如果不能很好控制，將會(huì )X光片上曝光過(guò)度。解決這個(gè)問(wèn)題的策略是減少結合的試劑的量，例如抗體或類(lèi)似物。曝光時(shí)間1到10分鐘通常是足夠顯現大多數的印跡。更長(cháng)的很少能提高信號/背景。

　　關(guān)于靈敏度相對的方面來(lái)講，未得到信號并不意味著(zhù)分析物的不存在。任何一種光學(xué)用膜片都有一個(gè)強度閾值，在這個(gè)閾值之上銀顆粒的光化學(xué)轉化才能成功。否則會(huì )失敗，稱(chēng)之為“可逆失敗”。在實(shí)際操作中，化學(xué)發(fā)光信號低于閾值強度的結果僅是簡(jiǎn)單的沒(méi)有記錄。更長(cháng)時(shí)間的曝光也不能克服這個(gè)問(wèn)題?？梢酝ㄟ^(guò)一些方法來(lái)改進(jìn)，在曝光之前如把膜片放在氫氣和氮氣的混合氣體中預閃，即用低強度的光短時(shí)間的照射膜片，以提高光學(xué)顆粒的光子。

　　CCD成像技術(shù)——zui近，基于CCD的影像系統已成為化學(xué)發(fā)光印跡結果獲得和記錄的好工具。這些系統在信號測試的動(dòng)態(tài)范圍上表現出很好的效果。CCD的量度大小為3～4個(gè)級數，而X光片僅為1個(gè)級數。攝像時(shí)間短，并且可以獲得多個(gè)影像和容易存儲。雖然需要投入設備的購置費，但是可以節省膜片和其它的投入。

　　設備(光電倍增管)

　　在發(fā)光儀上，PMT為傳統的選擇。它們的優(yōu)勢包括良好的靈敏度，寬廣的動(dòng)態(tài)范圍和較寬的光譜相應。因為PMT具有很低的暗電流，使得它們具有的信噪比。

　　PMT有兩種基本模式——單光子計數和電流感應。有些復合系統是在每秒百萬(wàn)個(gè)光子以下為單光子模式，超過(guò)之后為電流感應。

　　PMT單光子計數系統是超靈敏的。用這類(lèi)檢測器主要是為了滿(mǎn)足靈敏度要求較高的測試和定量。越高要求的靈敏度，價(jià)格越高。樣品測試室必須是光密閉性非常好的。如果光太強會(huì )損害PMT。

　　PMT電流感應系統也能獲得較好的靈敏度，經(jīng)常用于比單光子計數系統檢測的更強的光。

　　對于選擇何種模式的PMT檢測器，需要與你的實(shí)際需要結合起來(lái)選擇?，F在，這兩種檢測器的化學(xué)發(fā)光儀操作都比較簡(jiǎn)單，靈敏度也都比較好。對此有一個(gè)正確的理解，你就可以選擇一個(gè)比較適合你的應用的設備。

　　PMT主要應用在液相中化學(xué)發(fā)光的檢測，儀器形式可以為管式和板式。其檢測結果單位值為RLU(Relative Light Unit)，各個(gè)公司生產(chǎn)的產(chǎn)品其對RLU的定義會(huì )有所不同。